شاید این مطالب برایتان مفید باشد

رنگ آميزي كانيون (زيل‌نلسون اصلاح شده)

بهمن ۲, ۱۳۹۸

سرطان پستان

اسفند ۵, ۱۳۹۷

چالش های آزمایشگاهی در ارتباط با تشخیص عفونت های قارچی

بهمن ۱۷, ۱۳۹۷

آزمايشگاه قارچ شناسي می تواند كمكها و راهنمائيهاي موثري در اختيار پزشك قرار دهد که از جمله مي توان به موارد زير اشاره كرد: كمك به تشخيص قطعي بيماري، تائيد تشخيص باليني، ارزيابي پاسخهاي درماني، تائيد پاك شدن بافت هاي آلوده ی  بيمار از پاتوژن و برطرف شدن عفونت، اندازه گيري سطح خوني داروهاي ضد قارچي و بالاخره تعيين حساسيت داروئي ايزوله هاي جدا شده از نمونه های كلينيكي.

تست هاي قابل دسترسي شامل آزمايش هاي ميكروسكپي، كشت، سرولوژي و در صورت لزوم برخي از تست هاي غير روتين از قبيل آزمايشهاي اندازه گيري ايمني سلولي (مانند آزمايشMI , TT ، فاگوسيتوز، انهدام داخل سلولي پاتوژن) و ارزيابي عناصر اختصاصي مقاومت طبيعي بدن مي باشند.

برخي از روشهاي آزمايشگاهي در نشان دادن بيماري و عفونت نسبت به روشهاي ديگر مزيت دارند. تفسير اين نتايج گاهي اوقات با اطمينان و اعتماد كافي صورت مي گيرد ولي گاهي يافته هاي آزمايشگاهي ممكن است گمراه كننده بوده و چندان مفيد نباشند. انتخاب بهترين روش آزمايشگاهي متكي بر اطلاعات مفيد كلينيكي (علائم ظاهر شده بيماري و محل عفونت) و امكانات تشخيصي موجود و در دسترس مي باشد. بنابر اين ارتباط و همكاري نزديك بين پزشك و آزمايشگاه در اين راستا بسيار ضروري و راهگشا خواهد بود.

آزمايش مستقيم ميكروسكپي براي تشخيص بسياري از ميكوزهاي سطحي و زير جلدي از ارزش تشخيصي بالائي برخوردار است. بعنوان مثال مشاهده ی  سلولهای مخمری با جوانه و بدون جوانه  به همراه هايفی های کوتاه و خميده در نمونه های پوسته يا شوره های حاصله از ضايعات پوستی نشاندهنده ی  بيماری تينا ورسيکالر ميباشد و يا اينکه سلولهاي كپسول دار و مخمري كريپتوكوكوس نئوفرمنس در مايع نخاع يك يافته سريع و قابل اعتماد مربوط به بيماري كريپتوكوكوزيس مي باشد. با اينحال در بسياري از موارد نمونه و ماده ی مناسب براي انجام آزمايش مستقيم ميكروسكپي قابل تهيه و يا قابل دستيابي نيست. از طرف ديگر جداسازي يك پاتوژن فرصت طلب مانند كانديدا آلبيكنس در محيط كشت تنها در صورتي معتبر و ارزشمند است كه در آزمايش مستقيم ميكروسكپي نيز سلولهاي مخمري يا هايفاي كاذب آن ديده شده باشد.

صرف نظر از شواهد بافت شناسي مربوط به عفونت هاي قارچي كه در موارد خاصي تنها روش تشخيصي با ارزش مي باشد، نتايج اكثر آزمايشات ديگر در صورتي رضايت بخش و معتبر خواهد بود كه با روشهاي ديگر كه همزمان بكار گرفته شده اند و نيز با علائم باليني و تاريخچه بيماري فرد مطابقت داشته باشند. بايد توجه داشت كه يافته هاي مثبت هميشه ارزش تشخيصي بالقوه زيادي نسبت به يافته هاي منفي دارند،  بنابر اين رد كردن يك بيماري قارچي بر اساس نتايج تست هاي آزمايشگاهي بايد با احتياط صورت گيرد. بايد توجه داشت كه هر تست آزمايشگاهي محدوديت هاي خاص خود را دارد و نتايج منفي ممكن است موجب تاخير جدي در تشخيص بموقع عفونت و يا حذف ناخواسته و بي مورد يكي از تشخيصهاي افتراقي (عفونت قارچي) گردد.

آزمايشهاي ميكروسكپي :

معمولا عناصر قارچي موجود در بافتهاي عفوني شده ، اكسوداها يا مايعات بافتي به اندازه ی  كافي بزرگ و قابل مشاهده با ميكروسكوپ نوري هستند اگرچه ممكن است اين سلولها  به تعداد زياد وجود نداشته باشند و يا به شكلهاي خاص و اشتباه بر انگيزي ديده شوند. بعنوان مثال سلولهاي گرد و منفرد را نمي توان به سادگي از عناصر سلولي ميزبان يا از  قطعات نسوج مرده يا مواد خارجي (آرتيفكت ) تميز داد. مزيت اصلي آزمايش مستقيم ميكروسكوپي سرعت عمل آن است كه بدين وسيله تشخيص فرضي (presumptive) يا ابتدائي روي نتايج مثبت استوار مي گردد. آزمايش مستقيم ميكروسكپي عمدتا براي تراشه هاي پوست، مو و ناخن (كه در محلول پتاس ۱۰ تا ۲۰ در صد شفاف شده اند)، چرك، اكسوداي سروز و خلط بكار مي رود.

شناخت عناصر قارچي درچنين نمونه هايي براي برخي از بيماريها مانند درماتوفيتوزها ارزش تشخيصي مهمی دارد. آزمايش مستقيم ميكروسكپي ميتواند در تأييد تشخيص كرومومايكوزيس (مشاهدة اجسام اسكلروتيك در تراشه هاي پوست) و نيز مايستوما (دانه ها ياگرانولهاي قارچي) كمك مؤثري بنمايد . شناسايي قارچهاي پاتوژن نه تنها بر اساس تعداد زياد آنها در بافتهاي آلوده بلكه با توجه به مرفولوژي مشخص و منحصر به فرد آن نيز صورت مي گيرد. در بعضي مواقع بدليل وجود مشابهت هائي بين برخي عناصر سلولي ميزبان، آزمايشگاه ممكن است فقط قادر به گزارش مشاهده عناصر قارچي گردد(Fungal elements seen)  بدون آنكه نوع و مشخصات آن را ذكر كرده باشد. در چنين مواردي اينگونه گزارشها براي پزشك تنها جنبة هشدار دهنده داشته و امكان وجود يك نوع ميكوز را خاطر نشان مي سازد و بنابراين مطالعات قارچ شناسي بيشتري را براي رد يا اثبات آن خواهد طلبيد.

گسترش هاي تهيه شده و رنگ آميزي شده با گرم براي تشخيص اكتينومايكوزيس مفيد است. براي تشخيص نوكارديوز از رنگ آميزي گرم و اسيدفست اصلاح شده می توان بهره برد. در صورتيکه نمونه هاي چرك ، مغز استخوان يا خلط براي جستجوي هيستوپلاسما كپسولاتم مورد نظر باشد،  ابتدا بوسيله الكل متيليك ثابت (فيكس) نموده و با گيمسا رنگ آميزي نماييد. براي قارچهاي ديگر علاوه بر اينها از رنگ آميزي پاس(PAS) نيز مي توان استفاده نمود. در اكثر موارد تهيه يك اسلايد  رنگ نشده و مرطوب شده با محلول پتاس ۱۰ درصد و مشاهدة فوري آن (ميكروسكوپي) بسيار مفيد و سودمند است. از آنجا كه ميلين (myelin)  موجود در چرك ، خلط و پوست در اثر باقي ماندن در مجاور محلول پتاس يا سود وارد واكنش شده و مواد مصنوعي (artifacts)  توليد مي شود كه از نظر شكلي مشابه هايفاي قارچ و اشكال جوانه اي قارچها است بنابر اين بهتر است بلافاصله بعد از تهية لام با محلول پتاس ( و در صورت لزوم با گرم كردن آن روي شعله البته طوري كه به جوش نيايد) مورد مشاهده ی  ميكروسكوپي قرار گيرد.

كشت :

قارچهاي پاتوژن را معمولأ با استفاده از محيط هاي كشت مناسب مي توان از بافتهاي عفوني جدا كرد. موقعيكه يك ارگانيسم پاتوژن مانند هيستوپلاسما كپسولاتوم يا يك قارچ درماتوفيت از كشت مربوط به نمونه يا بافت آلوده جدا شد ، بدون هيچگونه ابهامي تشخيص بيماري تأئيد شده است. مشكل و محدوديت مربوط به كشت قارچها مربوط به زمانهاي نسبتأ طولاني نگهداري محيط كشت و ارائه يافته ها بعد از گذشت چندين هفته است كه البته در طي اين مدت معمولأ درمانهاي ضد قارچي توسط پزشك شروع شده است. (البته امروزه با بكار گيري روشهاي تشخيص ملكولي مانند PCR  اين محدوديت تا حدودی رفع شده است). در رابطه با بيماريهاي قارچي فرصت طلب در بسياري از مواقع كشت هاي مثبت از ارزش كمي برخوردار   مي باشند مگر آنكه با شواهد و مدارك اضافي كه توسط آزمايش ميكروسكوپي يا سرولوژي بدست آمده باشد مطابقت داشته باشند. به هر حال كشت نمونه هاي مشكوك به آلودگي قارچي بايد  هميشه انجام گيرد اگرچه بعنوان يك روش تأئيد كننده(confirmatory)  در نظر گرفته شده باشد.

سرولوژي :

آشکار کردن و اندازه گيری  آنتي باديهای اختصاصی در تشخيص بيماريهاي قارچي  مفيد و سودمند است بويژه هنگامی که براي تشخيص ميكوزهاي عمقي مانند هيستوپلاسموزيس يا كوكسيديوئيدومايكوزيس بكار گرفته شوند. در غياب يافته هاي مثبت توسط روشهاي آزمايشگاهي مختلف ، شناسائي آنتي باديهاي مربوط به قارچ پاتوژن مورد نظر به همراه علائم و نشانه هاي باليني نقش اشاره كننده ( suggestive)، پشتيباني كننده (supportive) و يا تشخيصي ( diagnostic) خواهد داشت. ارزش بعضي از تستها نيز فقط در حد اطلاعات پايه اي (baseline) مي باشد كه در ارزيابي هاي بعدي در ارتباط با رابطه ميزبان – پارازيت (قارچ) مي تواند مفيد باشد. از طرفي واكنش هاي متقاطع بين آنتي ژنهاي قارچهاي مشابه و حتي غير مشابه مسئلة شايعي است كه مي تواند موجب اشتباه در تشخيص بيماري فعلي گردد. البته تعقيب و پيگيری  پاسخهاي سرولوژيكي در تستهاي بعدي معمولأ پزشك را از اين اشتباه و ترديد رها         مي سازد، بايد خاطر نشان ساخت که مشاوره بين كلينيك و آزمايشگاه مشكلات ناشي از نتايج مثبت و منفي كاذب را به حداقل ممكن مي رساند. بزرگترين مشكل در تستهاي سرولوژي (سرودياگنوستيك) نارسائي اين روشها در تشخيص بيماريهاي قارچي مهاجم در افرادي است كه سيستم ايمني آنها سركوب و يا تضعيف شده باشد. نكته ی قابل توجه در اين رابطه اين است كه اين تستها در جهت شناسائي آنتي ژنهاي سرگردان يا كمپلكسهاي ايمني توسعه يافته اند. بعنوان مثال اين قبيل تستها كمك هاي مؤثري  در تشخيص كانديديازيس مهاجم يا آسپرجيلوزيس مهاجم مي کنند.

بافت شناسي :

 چنانچه مقاطع تهيه شده در آزمايش ميكروسكپي  واجد سلولهاي قارچي باشد  نتايج به نفع تشخيص قطعي عفونت است.  بعضي از قارچها ( كوكسيديوئيدس ايميتيس، هيستوپلاسماكپسولاتم، بلاستومايسس درماتيتيديس، آسپرجيلوس فوميگاتوس، كريپتوكوكوس نئوفرمنس، پاراكوكسيديوئيدس برازيلينسيس و عوامل مايستوما، كرومومايكوزيس، فئوهايفومايكوزيس و زايگومايكوزيس) را مي توان در مقاطع بافتي رنگ آميزي شده با هماتوكسيلن – ائوزين براحتي مشاهده كرد اگر چه لازم است وجود سلولهاي قارچي در مقاطع بافتي هميشه با استفاده از رنگ آميزي هاي اختصاصي ويژة قارچها (گوموری متنامين سيلور، موسيکارمين و …) تآئيد شود. اين مسئله بخصوص در موارديكه تعداد سلولهاي قارچي در نمونه ی  بافت اندك است ، اهميت بيشتري پيدا مي كند. براي اين منظور بيشتر از رنگهاي  PAS  يا متنامين سيلور استفاده مي شود.

مرفولوژي قارچ در بافت براي شناسائي آن بسيار مهم است اگرچه به اندازه ی مرفولوژي آن در كشت ارزش ندارد. يك استثنا در مورد قارچهاي رنگي (ديماتياسئوسها) وجود دارد و آن اينكه در داخل بافت منظره اختصاصي و منحصر به فردي دارند و با ساير قارچها (مخمرها و هيالن هيفوميستها ) اشتباه نمي شوند. در مورد پاتوژنهاي ديگر براي رسيدن به يك تشخيص قطعي به كشت از نمونه و جدا كردن قارچ در كشت خالص نيازمند مي باشيم.

آزمايش مقاطع بافتي كه در نتيجه ی  بيوپسي بدست آمده اند لزوما توسط روشهاي هيستولوژيكي استاندارد صورت مي گيرد و نكتة مهم تر اين است كه از رنگهاي اختصاصي از قبيل پاس (Periodic Acid-Schiff) , Gridley , Mucicarmine , Methenamine silver  استفاده شود.

در جداول زير روشهاي مختلف آزمايشگاهي از نظر نقش آنها در تآئيد و يا رد بيماريهاي قارچي نشان داده شده و مورد مقايسه قرار گرفته اند:

 

نوع عفونت قارچی	آزمايش مستقيم Direct Microscopy	مقطع بافتي Tissue Section	كشت	سرولوژي
سطحي (superficial)	+++	–	++	–
زيرجلدي (subcutaneous)	++	+++	+	+
سيستميك	++	+++	++	++
فرصت طلب	+	+++	+	+

ارزش تشخيصي روشهاي آزمايشگاهي براي گروههای مختلف عفونتهاي قارچي

توضيح :

+++  : در صورت مثبت شدن ارزش تشخيص قطعي دارد

++   : ممكن است دياگنوستيك باشد اما گاهي اوقات نتيجه منفي است

+    : اهميت آن ممكن است نامشخص باشد ، نتايج بعد از مدتي تآخير قابل دستيابي است ويا اينكه مي توان گفت نتايج گاهي اوقات مثبت است

ـ    : آزمايش نامناسب است

 

بهترين تستهاي آزمايشگاهي	سرولوژي	كشت	بافت شناسي	آزمايش مستقيم ميكروسكوپي	عامل يا عوامل قارچي	نام بيماري
آزمايش مستقيم ميكروسكپي و كشت	———	تائيد كننده	——–	تشخيص قطعي	تريكوفيتونها ، ميكروسپورومها ، اپيدرموفايتون	درماتوفيتوز
آزمايش مستقيم ميكروسكپي	———	سودمند نمي باشد	——–	تشخيص قطعي	مالاسزيا فورفور	پيتريازيس ورسيكالر
آزمايش مستقيم ميكروسكپي و كشت	محدود	تائيد كننده	تشخيص قطعي	تشخيص قطعي	گونه هاي فونسكا ، فيالوفورا و كلادوسپوريوم كاريوني	كرومومايكوزيس
آزمايش مستقيم ميكروسكپي ، كشت و سرولوژي	بين عوامل قارچي و اكتينومايستي   مي تواند افتراق نشان دهد	تائيد كننده	تشخيص قطعي	مي تواند دياگنوستيك باشد	گونه هاي مختلف قارچها و اكتينوميستها	مايستوما
كشت	مفيد است اما غير اختصاصي است	تائيد كننده	ارزش دياگنوستيكي كمي دارد	ارزش كمي دارد (معمولا منفي است )	اسپوروتريكس شنكئي	اسپوروتريكوز(لوكاليزه )
آزمايش مستقيم ميكروسكپي ، كشت و سرولوژي	ارزشمند (DD)	تشخيص قطعي	تشخيص قطعي	تشخيص فرضي(معمولا منفي است)	بلاستومايسس درماتيتيديس	بلاستومايكوز
آزمايش مستقيم ميكروسكپي ، كشت و سرولوژي	ارزشمند (DD, CF)	تشخيص قطعي	تشخيص قطعي	تشخيص قطعي يا فرضي (معمولا منفي است)	كوكسيديوئيدس ايميتيس	كوكسيديوئيدومايكوزيس
آزمايش مستقيم ميكروسكپي ، كشت و سرولوژي	ارزشمند (DD , CF)	تشخيص قطعي	تشخيص فرضي	سودمند نمي باشد	هيستوپلاسما كپسولاتوم	هيستوپلاسموز
آزمايش مستقيم ميكروسكپي ، كشت و سرولوژي	ارزشمند (IE , CF)	تشخيص قطعي	تشخيص قطعي يا فرضي	تشخيص فرضي (معمولا منفي است )	پاراكوكسيديوئيدس برازيلينسيس	پاراكوكسيديوئيدومايكوزيس
كشت و سرولوژي	مفيد است اما غيراختصاصي است	تائيد كننده	كم ارزش	ارزش كمي دارد (معمولا منفي است)	اسپوروتريكس شنكئي	اسپوروتريكوز (سيستميك)
بيوپسي و سرولوژي	مفيد اما معمولا منفي است (DD , CIE , ELISA)	مفيد اما معمولا منفي است	تشخيص فرضي	تشخيص فرضي (معمولا منفي است )	آسپرجيلوس فوميگاتوس و ساير گونه ها	آسپرجيلوزيس (مهاجم)
بيوپسي و سرولوژي	ميتواند مفيد باشد (DD , CIE , A , IFA , ELISA)	مفيد ( در مواقعيكه از محلهاي غير عادي جدا شده باشد)	تشخيص فرضي	مفيد(گاهي اوقات)	كانديدا آلبيكانس و ساير گونه ها	كانديدوز (سيستميك)
بيوپسي ، كشت و سرولوژي	مشكوك	مفيد اما معمولا منفي است	تشخيص فرضي	بندرت ارزشمند است	گونه هاي رايزوپوس ، آبسيديا و موكور	زايگومايكوزيس
آزمايش مستقيم ميكروسكپي و كشت	———	تائيد كننده	——–	تشخيص قطعي	قارچهاي مختلف	انيكومايكوز اتومايكوزيس كراتيت قارچي
آزمايش مستقيم ميكروسكپي ، كشت و سرولوژي	ارزشمند(DD , CIE)	مفيد	——–	ارزشمند	آسپرجيلوس فوميگاتوس	آسپرجيلوزيس آلرژيك
آزمايش مستقيم ميكروسكپي ، كشت و سرولوژي	ارزشمند (DD , CIE)	تشخيص قطعي	تشخيص قطعي	تشخيص فرضي (معمولا منفي است)	آسپرجيلوس فوميگاتوس و ساير گونه هاي آسپرجيلوس	آسپرجيلوما

مقایسه میزان ارزشمندي تسها و روشهاي آزمايشگاهي در تشخيص   عفونتهای قارچی

 

DD: Double diffusion

CIE: Counterimmunoelectrophoresis

CF: Complement fixation

A: Agglutination

IFA: Indirect fluorescent antibody

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

IE: Immunoelectrophoresis