دکتر محمد قهری
هدف: جداسازی و شناسائی اولیه کلنی های درماتوفیتی
مواد و وسایل لازم: محیط کشت سابورودکستروز آگار، کلرآمفنیکل (پودر یا آمپول و یا کپسولِ آن)، پودر اکتیدیون (سیکلوهگزامید)، ارلن مایر ۱ لیتری و ۲ لیتری، استوانه مدرج یک لیتری، آب مقطر، شعله گاز، اتوکلاو، پنبه یا فویل آلومینیمی
روش تهیه محیط کشت: مقدار ۶۵ گرم از پودر محیط کشت را وزن کرده، یک استوانه مدرج یک لیتری را نیز از آب مقطر به اندازه یک لیتر پر کرده، ابتدا مقداری از حجم آن را به ارلن ۲ لیتری* تخلیه کرده سپس پودر توزین شده ی محیط کشت را به آن افزوده و در نهایت حجم آب باقیمانده را بر روی آن اضافه می کنیم. آنگاه ارلن مایرِ محتوی محیط کشت را با کمک شعله گاز و یا هیتر مغناطیسی تا دمای جوش حرارت می دهیم. در صورتیکه از شعله ی گاز استفاده شود، همزمان با حرارت دادن، آن را تکان می دهیم تا مانع رسوب محیط کشت در ته ظرف گردیم. هنگامیکه محیط به نقطه ی جوش رسید و کاملا شفاف شد، حال مقدار ۵۰ میلی گرم از پودر کلرامفنیکل را با کمک ترازوی حساس وزن کرده و در ۱۰ میلی لیتر اتانول خالص حل کرده و سپس آن را به محیط کشت ذوب شده می افزائیم. همچنین مقدار ۵۰۰ میلی گرم از پودر سیکلوهگزامید را وزن کرده و ابتدا در مقداری استون (مثلا در ۲۰ میلی لیتر) حل کرده و آنگاه به ظرف محیط کشت می افزائیم. سپس درب آن را با کمک پنبه و یا فویل آلومینیمی مسدود کرده و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در درمای ۱۲۱ درجه و فشار ۱۵ پوند بر اینچ مربع اتوکلاو می نمائیم.
*تذکر: بهتر است هنگام تهیه ی محیط کشت همیشه از ظرفی استفاده گردد که حجم آن ۲ برابر حجم محیط کشت مورد نظر باشد تا هم خوردن و مخلوط شدن آن سهل تر انجام شود.
بعد از اتمام زمان اتوکلاو صبر می کنیم تا درمای ظرف به حدود ۵۰ الی ۵۵ درجه برسد سپس آن را در بوات دوپتری های ۸ یا ۱۰ سانتیمتری تا عمق حدود ۴ یا ۵ میلی متر پر می کنیم.
کنترل کیفی: بعد از آنکه محیط های کشت سرد شده به حالت جامد درآمدند یکی از آنها را در دمای ۳۷ درجه بمدت ۲۴ ساعت و یک پلیت دیگر را دمای معمولی آزمایشگاه به مدت ۳ روز نگاهداری می کنیم تا از عدم آلودگی آنها در طی این زمان مطمئن شویم. در صورت عدم رشد هیچگونه کلنی باکتریائی یا قارچی در طی مدت مذکور، این محیط ها قابل استفاده خواهند بود.
به منظور بررسی صحت محیط کشتِ ساخته شده در یکی از پلیت ها مقداری از کلنی میکروسپوروم کانیس، یا تریکوفیتون منتاگروفیتس، و یا اپیدرموفیتون فلوکوزوم (هر یک که در دسترس باشند) کشت داده و به مدت یک هفته در دمای آزمایشگاه نگاهداری می کنیم. در صورت رشد کلنی مربوطه محیط های ساخته شده از کیفیت مناسبی جهت کشت نمونه های درماتوفیتی برخوردار خواهند بود.
منبع: قارچ شناسی پزشکی، تالیف دکتر مسعود امامی و همکاران. انتشارات دانشگاه علوم پزشکی تهران
