دکتر محمد قهری
توجه: تا قبل از انجام كشت، نمونه نبايد در يخچال قرار گيرد زيرا استرينهاي كريپتوكوكوس نسبت به دماي پائين حساس بوده و از بين می روند.
- ابتدا نام و مشخصات بيمار در دفتر قارچ‌شناسي بدقت ثبت شود.
- حجم نمونه اندازه گيري و ثبت شود.
- رنگ و ميزان شفافيت يا كدورت نمونه بدقت ثبت شود.
- تمام نمونه بمدت ۱۵ دقيقه با دور ۱۰۰۰ سانتريفوژ شود.
- مايع روئي به لوله استريل ديگري براي انجام تستهاي سرولوژيك منتقل شود.
از رسوب نمونه(pellet) آزمايش مستقيم ميكروسكپي و كشت انجام می شود. ابتدا رسوب را خوب به هم زده تا مخلوط همساني بدست آيد، سپس:
الف- آزمايشهاي ميكروسكپي از رسوب:
- آزمايش مستقيم ميكروسكپی:
هدف: بررسي وجود يا فقدان عناصر قارچي (هايفي كاذب و مخمرهاي جوانه دار) و آميبهاي آزاد(نگلريا يا آكانتاموبا)
روش كار: تهيه لام مرطوب بصورت مستقيم با برداشت يك قطره از رسوبي كه خوب مخلوط شده‌است و قرار دادن آن روي لام و مشاهده ميكروسكپي با عدسي ۱۰ و ۴۰ . وضعيت گلبولهاي قرمز و سفيد نيز در اين آزمايش از نظر فراواني در نظر گرفته مي شود.
- تهيه لام با مركب چين: يك قطره از رسوب CSF را روي لام قرار داده و به آن يك قطره مركب چين (كه حجم آن يك سوم حجم قطره‌ي برداشت شده از مايع CSF باشد) افزوده و بعد از مخلوط كردن با عدسي ۱۰ و ۴۰ بررسي کنید. در صورت وجود سلولهاي مخمري كپسول دار اطراف اين سلولها هاله ي ضخيم و شفافي ديده می شود و با عدسي ۱۰ منظره شبيه آسمان سياه پرستاره مشاهده می گردد. برخي از استرينهاي كريپتوكوك فاقد كپسول و يا برخي ممكن است داراي كپسول ظريفي باشند. مخمرهاي كپسول دار در csf حدود ۶۰درصد بيماران مبتلا ديده می شود. حساسيت اين آزمايش را از ۶۰% تا ۷۲% گزارش كرده اند.
توجه : براي تهيه لام جهت رنگ آميزيهاي زير ابتدا لام را به صورت زير تهيه كنيد:
يك قطره درشت از رسوب را روي لام قرار داده و بدون اينكه آن را پهن كرده يا بگسترانيد اجازه دهيد در مجاورت هوا خشك شود. بعد از خشك شدن يك قطره‌ي ديگر به همين شكل روي قطره‌ي خشك شده ريخته و مجددا اجازه دهيد تا در مجاورت هوا خشك شود. سپس لام را با كمك حرارت مختصر و يا بكمك متانول فيكس نموده و رنگ‌آميزيهاي زير را انجام دهيد. (به اينصورت يك گسترش نسبتا ضخيم و پرسلول حاصل خواهد شدكه مشاهده و بررسي ميكروسكپي آن سريع‌تر و دقيق‌تر خواهد گرديد).
۳- رنگ آميزي گيمسا يا رايت گيمسا: از همان دستورالعمل رنگ آميزي براي هماتولوژي استفاده ميشود. هدف بررسي وضعيت گلبولهاي سفيد از نظر غالب بودن منونوكلئرها يا پلي نوكلئرها و نيز مشاهده احتمالي سلولهاي مخمري می باشد.
۴- رنگ آميزي گرم: هدف بررسي وجود احتمالي عناصر باكتريال و نيز سلولهاي مخمري می باشد.
۵– رنگ آميزي كانيون: براي بررسي وجود احتمالي باكتريهاي رشته اي نظير نوكارديا، اكتينوميسس و يا استرپتوميسسها می باشد.
ب- كشت از رسوب در محيط هاي زير انجام گيرد:
سابورودكستروز آگار، سابورو كلرآمفنيكل دار، BHI و انكوباسيون در دماي آزمايشگاه يا ۳۰ درجه سانتيگراد به مدت ۲ تا ۵ روز
محيط ژلوز خوندار و انكوباسيون در ۳۷ درجه سانتيگراد و محيط ژلوز شكلاتي و انكوباسيون در شرائط ۵ تا ۱۰ درصد گاز كربونيك و ۳۷ درجه سانتيگراد به مدت ۲ تا ۵ روز
محيط كشت Lowenstein-Jensen: كشت از نظر AFB در هر نمونه بايد صورت گيرد. اين كشت ها تا يكماه بايد در شرائط ۳۷ درجه سانتيگراد. نگهداري شوند.
توضيحات:
ميزان حساسيت كشت را حدود ۵۶% گزارش ميكنند. كشت حجم زيادي از نمونه و در بعضي موارد كشت نمونه هاي متعدد حساسيت كشت را افزايش مي دهد.
پليت هاي حاوي محيط هاي كشت فوق را بايد روزانه از نظر رشد بررسي و تا ۳ هفته نگهداري كرده و در صورت عدم رشد بعد از ۳ هفته منفي تلقي نمود. رشد هرگونه كلني با رنگ آميزي گرم مورد بررسي قرار گيرد ودر صورت مشاهده سلولهاي مخمري رنگ آميزي كپسول (مركب چين و يا رنگ نيگروزين۱۰%) انجام شود.
كريپتوكوكوس نئوفرمنس معمولا ظرف ۲ تا ۳ روز بصورت كلنيهاي كرم رنگ سفيد تا زرد مايل به قهوه اي ظاهر می شوند. استرينهاي كپسول دار كلنيهاي براق و درخشاني را ايجاد مي كنند و استرينهائي كه فاقد كپسول بوده يا كپسول ضعيفي دارند خشك به نظر می رسند.
ممكن است بعد از ۲۴ الي ۴۸ ساعت كلنيهاي سفيد خامه اي با هاله ي صورتي ظاهر شوند كه بعد از ۵ تا ۸ روز بصورت كلنيهاي صاف، مرطوب و موكوئيدي به نظر برسند. در محيط سابورو مالتوز آگار كلنيها رنگ گل اخرا به خود می گيرند.
در محيط EMB بعد از يك هفته بصورت مرطوب و سيال در مي آيند.
در صورت رشد كلني هاي مخمري مشكوك به كريپتوكوكوس نئوفرمنس:
تست هيدروليز اوره در محيط chrisensen’s urea agar ( نتيجه مثبت است)
تست احياء نيترات (نتيجه منفي است)
تست فنل اكسيداز (نتيجه مثبت است)
